實(shí)驗(yàn)原理

磁轉(zhuǎn)染TM 是一種新穎、簡(jiǎn)單而高效的細(xì)胞體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法。這項(xiàng)技術(shù)利用磁力來(lái)驅(qū)動(dòng)結(jié)合了磁性粒子的核酸進(jìn)入靶細(xì)胞，從而使細(xì)胞能在幾分鐘之內(nèi)獲得*劑量的RNA或DNA，且各細(xì)胞獲得量基本一致。NeuroMag是一個(gè)專為初級(jí)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞系的高效率轉(zhuǎn)染而設(shè)計(jì)的磁性納米粒子配方，是神經(jīng)科學(xué)研究中一種理想的轉(zhuǎn)染試劑。

如今可以非常高效地將各類核酸如DNA、RNA或寡核苷酸轉(zhuǎn)染進(jìn)初級(jí)神經(jīng)元和永生化神經(jīng)細(xì)胞中，特別是原代海馬細(xì)胞或皮質(zhì)激素神經(jīng)元細(xì)胞。NeuroMag兼容于血清，可以用于瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，是一種非常穩(wěn)定，可應(yīng)用的和僅用于研究目的技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)試劑

1. 分離液：含0.25％D-葡萄糖的HBSS（無(wú)鈣，鎂），保持在4°C，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2. 培養(yǎng)基：MEM中加入10％的Nu-血清，15mM的pH值7.2的HEPES，0.45％葡萄糖，1mM丙酮酸鈉，2mM的L-谷氨酰胺，10 IU/ml的青-鏈霉素。

3. 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：MEM中加入2%的B27，15mM的HEPES，葡萄糖0.45％，1mM的丙酮酸鈉，2mM谷氨酰胺。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

組織培養(yǎng)容器準(zhǔn)備：

1. 將水溶性多聚L-賴氨酸（Sigma公司，P-1520）0.1 mg/mL溶于水中（分裝和存儲(chǔ)在-20°C）。

2. 將蓋玻片或培養(yǎng)皿用多聚L-賴氨酸覆蓋。

3. 37°C孵育過(guò)夜。

4. 水沖洗兩次。

5. 在無(wú)菌層流罩中干燥

實(shí)驗(yàn)材料

海馬神經(jīng)元細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞系

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 細(xì)胞

    1) 原代神經(jīng)元細(xì)胞：一般來(lái)說(shuō)培養(yǎng)了7至21天的細(xì)胞都可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但體外培養(yǎng)天數(shù)(DIV)為10-15天(依據(jù)不同的培養(yǎng)條件)的細(xì)胞用來(lái)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)更換50％的培養(yǎng)基。

    2) 細(xì)胞系：于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的前一天準(zhǔn)備。

2. DNA / NeuroMag復(fù)合物的制備

    1) NeuroMag：渦旋并適量加入至微管中。

    2) DNA：稀釋數(shù)量的DNA至50~700微升的無(wú)血清和補(bǔ)充的培養(yǎng)基中

    3) 將上述DNA溶液加入到NeuroMag溶液中，渦旋或吹打后在室溫下孵育15至20分鐘。

3. 轉(zhuǎn)染

    1) 將NeuroMag / DNA復(fù)合物逐滴添加到培養(yǎng)的細(xì)胞(細(xì)胞> 10 DIV時(shí)，生長(zhǎng)于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，如果<10DIV，則培養(yǎng)于培養(yǎng)基中)，輕拍培養(yǎng)板以確保均勻分布，于15分鐘內(nèi)置于磁板之上。

    2) 移除磁板。

    3) 細(xì)胞在37°C 標(biāo)準(zhǔn)條件下于CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因表達(dá)(24小時(shí)至7天)。

    4) 方法的優(yōu)化

雖然上述快速方法轉(zhuǎn)染效率較高，但在特定的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)中，可能需要優(yōu)化如下幾個(gè)參數(shù)以獲得最高的轉(zhuǎn)染效率：核酸的劑量、NeuroMag與核酸的比例、細(xì)胞密度和孵化時(shí)間。建議您一次優(yōu)化一個(gè)參數(shù)。

        a. 優(yōu)化DNA的量

為達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)染效率，DNA的量可以增加或減少。重要的是要始終保持不斷優(yōu)化過(guò)程中的細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間。調(diào)整DNA最佳量時(shí)需要維持一個(gè)NeuroMag與DNA的固定比例(每微克DNA用3.5μg的NeuroMag)，在建議的范圍進(jìn)行調(diào)整。

        b. NeuroMag / DNA比值的優(yōu)化

首先保持一個(gè)固定數(shù)量的DNA(根據(jù)您的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞數(shù)量和以前的優(yōu)化結(jié)果)，然后在2至5μL的范圍內(nèi)調(diào)整每微克DNA中NeuroMag的量。

        c. 細(xì)胞數(shù)量

細(xì)胞數(shù)量(密度)也是一個(gè)重要的參數(shù)，為達(dá)到良好的轉(zhuǎn)染效率，根據(jù)所使用的細(xì)胞進(jìn)行調(diào)整的最佳調(diào)整。合適的細(xì)胞密度取決于增長(zhǎng)率和細(xì)胞的培養(yǎng)條件，同等條件下，較好的細(xì)胞融合度比低細(xì)胞密度好。

         d. 時(shí)間：

尋找轉(zhuǎn)染與細(xì)胞基因活性檢測(cè)，如啟動(dòng)子活性，表達(dá)產(chǎn)物等之間的孵育時(shí)間，可通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染24小時(shí)后到7天之間的基因產(chǎn)物來(lái)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率。報(bào)告基因如綠色熒光蛋白，β-半乳糖苷酶，堿性磷酸酶或熒光素酶可以用來(lái)定量測(cè)量基因表達(dá)。

    5) 共轉(zhuǎn)染

在對(duì)多個(gè)質(zhì)粒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染時(shí)，將每個(gè)質(zhì)粒取相同數(shù)量進(jìn)行混合，再依如上所述條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。例如，如果你有兩個(gè)DNA質(zhì)粒，則每質(zhì)粒取1微克，再與7μL的NeuroMag混合，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    6) 共轉(zhuǎn)染的選擇

共轉(zhuǎn)染只能實(shí)現(xiàn)順序轉(zhuǎn)染，而不能同時(shí)進(jìn)行。因此，一個(gè)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA4小時(shí)至24小時(shí)以后可以與其他質(zhì)粒DNA再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。兩步轉(zhuǎn)染之間可以更換培養(yǎng)基。

注意事項(xiàng)

1. DNA和 NeuroMag溶液在使用前應(yīng)回復(fù)至室溫，并輕柔渦旋。每微克DNA使用3.5µL的NeuroMag并實(shí)驗(yàn)需要來(lái)進(jìn)優(yōu)化。

2. 神經(jīng)細(xì)胞系：建議在轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞培養(yǎng)于玻片上。合適的細(xì)胞密度取決于增長(zhǎng)率和細(xì)胞的條件。在轉(zhuǎn)染期間細(xì)胞不應(yīng)該少于60％的融合度（細(xì)胞覆蓋生長(zhǎng)表面的百分比）。

3. 細(xì)胞密度是實(shí)現(xiàn)良好的轉(zhuǎn)染與低毒性的一個(gè)重要的參數(shù)，合適的細(xì)胞密度將取決于增長(zhǎng)速度和細(xì)胞的培養(yǎng)條件。